不同研磨方法對(duì)酵母菌DNA得率的影響

前段時(shí)間有實(shí)驗(yàn)員說(shuō)用酵母DNA試劑盒提取的酵母濃度很低，小新之前也提取過(guò)酵母DNA，記得濃度還可以，因此有點(diǎn)好奇。經(jīng)過(guò)與實(shí)驗(yàn)員溝通后小新懷疑是研磨方法不同導(dǎo)致的差異。小新之前提取酵母DNA用的是液氮研磨，而這次實(shí)驗(yàn)員提取時(shí)由于液氮?jiǎng)偤糜猛炅?，采用的是直接研磨的方法?/span>

酵母菌是一種真菌，具有細(xì)胞壁，想要提取酵母DNA首先就要將細(xì)胞壁破除。真菌的細(xì)胞壁和細(xì)菌不同，不能用溶菌酶破開(kāi)，需要使用破壁酶，而這種酶在市場(chǎng)上比較少見(jiàn)，價(jià)格也較為昂貴，因此一般采取機(jī)械研磨的方法來(lái)破除真菌細(xì)胞壁，較為常見(jiàn)的機(jī)械研磨方法就是液氮研磨和研磨珠研磨。為了驗(yàn)證研磨方法對(duì)DNA提取效率的影響，小新專門(mén)進(jìn)行了以下測(cè)試，讓我們一起來(lái)看看吧。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

測(cè)試不同研磨方法對(duì)酵母菌DNA得率的影響。

二、實(shí)驗(yàn)材料

1．新鮮培養(yǎng)的酵母菌、研缽、液氮、1.5 ml離心管若干。

2．酵母DNA試劑盒（Simgen Cat.No.3401050）、RNase A（50 mg/ml）（Simgen Cat.No.8001001）、樣本裂解管L（Simgen Cat. No.: C-001-1）、樣本裂解管M（Simgen Cat. No.: C-001-2）和樣本裂解管S（Simgen Cat. No.: C-001-3）

3．臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5415 D）、水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）、旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）、超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim-100）、電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

三、實(shí)驗(yàn)方法

1．收集過(guò)夜培養(yǎng)的酵母菌10 ml菌液，棄盡上清。

2．樣本的不同研磨方法：

直接研磨：

(1) 加入100 μl 70℃預(yù)熱的Buffer AT，勿棄吸頭，直接用吸頭吹打菌體沉淀，并將其吸出轉(zhuǎn)入研缽中，直接研磨約15分鐘左右充分破壞細(xì)胞壁。

(2) 向研缽中加入500 μl Buffer AT和2 μl RNase A，繼續(xù)研磨數(shù)次，用吸頭將裂解物轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管，70℃水浴5分鐘。

(3) 加入20 μl蛋白酶K貯存液，旋渦振蕩30秒混勻，70℃水浴20分鐘。水浴期間每隔2~3分鐘翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次以幫助DNA的釋放。

液氮研磨：

(1) 加入100 μl 70℃預(yù)熱的Buffer AT，勿棄吸頭，直接用吸頭吹打菌體沉淀，并將其吸出轉(zhuǎn)入研缽中。倒入液氮浸沒(méi)菌液（菌液碰到液氮后會(huì)立即凝集成塊），用力研磨直至菌塊呈粉末狀。

(2) 當(dāng)研成粉末狀的酵母開(kāi)始融化時(shí)，向研缽中加入500 μl Buffer AT和2 μl RNase A，繼續(xù)研磨數(shù)次，用吸頭將裂解物轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管，70℃水浴5分鐘。

(3) 加入20 μl蛋白酶K貯存液，旋渦振蕩30秒混勻，70℃水浴20分鐘。水浴期間每隔2~3分鐘翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次以幫助DNA的釋放。

樣品裂解管研磨：

（1）加入600 μl 70℃預(yù)熱的Buffer AT和2 μl RNase A，用吸頭吹打菌體沉淀，并將其吸出轉(zhuǎn)移到樣品裂解管中，旋渦振蕩15分鐘左右充分裂解酵母菌。70℃水浴5分鐘。

（2）加入20 μl蛋白酶K貯存液，旋渦振蕩30秒混勻，70℃水浴20分鐘。水浴期間每隔2~3分鐘翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次以幫助DNA的釋放。

（3）12000 rpm離心30秒，小心吸取上清至新的1.5 ml離心管中。

3．加入350 μl Buffer K，蓋上管蓋，用力搖晃15秒，旋渦振蕩30秒混勻。13000 rpm離心5分鐘。

4．將步驟3中的離心上清液倒入核酸純化柱（核酸純化柱置于2 ml離心管中）中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

5．棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6．棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7．棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，蓋上管蓋，13200 rpm離心2分鐘。

8．棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱中加入100 μl 70℃預(yù)熱的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置2分鐘，12000 rpm離心1分鐘得到酵母DNA。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零，測(cè)量洗脫下來(lái)的DNA，結(jié)果如下：

表一 三種研磨方法數(shù)據(jù)對(duì)比

表二 不同型號(hào)的樣品裂解管研磨酵母菌的數(shù)據(jù)對(duì)比

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的酵母DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如下：

                     圖一

M：1 kb plus DNA Ladder

1、2：直接研磨提取的酵母DNA

3、4：液氮研磨提取的酵母DNA

5、6：樣品裂解管M研磨提取的酵母DNA

圖二

M：1 kb plus DNA Ladder

1、2：樣品裂解管S研磨提取的酵母DNA

3、4：樣品裂解管M研磨提取的酵母DNA

5、6：樣品裂解管L研磨提取的酵母DNA

五、分析與討論

1. 由表一和圖一可知，三種研磨酵母菌的方法中，手動(dòng)研磨方法效果最差，提取到的酵母DNA平均僅有1.6 μg，液氮研磨方法提取到的酵母DNA平均能達(dá)到5.1 μg，樣品裂解管的研磨效果最好，提取到的酵母DNA平均高達(dá)11.9 μg，是液氮研磨方法的2倍多，是手動(dòng)研磨方法的7倍多。用玻璃珠震蕩法破碎酵母在很多文獻(xiàn)中都有記錄，在我們的實(shí)驗(yàn)中也得到了很好的驗(yàn)證。

2. 由表二和圖二可知，樣品裂解管M研磨酵母的效果是三種樣品裂解管中最好的。Simgen樣品裂解管目前有三種型號(hào)，L對(duì)應(yīng)的是土壤樣本，M對(duì)應(yīng)的是真菌樣本，S對(duì)應(yīng)的是細(xì)菌樣本，而酵母屬于真菌，對(duì)應(yīng)的是樣品裂解管M，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

3. 傳統(tǒng)液氮研磨方法在動(dòng)植物樣本的研磨上效果明顯，但是在面對(duì)細(xì)菌、真菌樣本時(shí)效果就不明顯了，原因就是細(xì)菌、真菌類樣本是單個(gè)細(xì)胞分開(kāi)的，研磨時(shí)看不出研磨效果，無(wú)法判斷是否研磨充分。而樣品裂解管可以根據(jù)樣本的大小選擇對(duì)應(yīng)大小的研磨珠，達(dá)到最好的研磨效果，比液氮研磨效果更好，且不用費(fèi)力研磨，只需拿著樣品裂解管旋渦振蕩就行，如果有條件，甚至可以購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)的震蕩儀，直接解放雙手。